cDNA文庫(kù)構(gòu)建是一種重要的分子生物學(xué)技術(shù)，可以用于快速克隆與表達(dá)特定基因的cDNA。本文將介紹cDNA文庫(kù)構(gòu)建的基本步驟及互作蛋白篩選方法。
一、cDNA文庫(kù)構(gòu)建
RNA提取——從目標(biāo)組織或細(xì)胞中提取總RNA，采用三氯化鋰等離子體法或Trizol法處理后測(cè)定RNA質(zhì)量，并在RNase-free條件下進(jìn)行操作。
cDNA合成——使用逆轉(zhuǎn)錄酶把RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中添加隨機(jī)引物，以確保對(duì)全長(zhǎng)cDNA的覆蓋。
后續(xù)處理——合成cDNA后，需要消除RNA殘余和RNA-cDNA雜交分子，如誘導(dǎo)雙鏈RNA（dsRNA）的副產(chǎn)物等。此步驟還可用于修剪多余部分，如啟動(dòng)子區(qū)域，3'端非編碼序列和其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。
cDNA片段連接——使用連接酶將修剪后的cDNA片段連接到載體上。這些載體通常是質(zhì)�；蚴删w，攜帶有切除酶酶切位點(diǎn)。連接后的文庫(kù)應(yīng)該被電轉(zhuǎn)化或感染到相關(guān)的細(xì)胞中，以便加以培養(yǎng)和篩選表達(dá)目的基因。
二、互作蛋白篩選方法
酵母雙雜交法——酵母雙雜交法是目前最廣泛使用的互作蛋白篩選技術(shù)之一。酵母細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄激活子結(jié)合到特定DNA序列上，從而實(shí)現(xiàn)報(bào)告基因表達(dá)的調(diào)控。這種方法可以用于鑒定蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，但不能鑒定酶與底物的相互作用。
噬菌體展示技術(shù)——噬菌體展示技術(shù)利用噬菌體顆粒表面的融合蛋白展示靶標(biāo)蛋白，鑒定融合蛋白與靶標(biāo)蛋白之間的相互作用。該方法通過(guò)遺傳學(xué)選擇或篩選技術(shù)可快速高效地獲得互作蛋白。
噬菌體展示技術(shù)
質(zhì)譜分析法——質(zhì)譜分析法是一種用于特定蛋白質(zhì)的互作鑒定的技術(shù)。它涉及把純化的互作復(fù)合物進(jìn)行質(zhì)量譜分析，比較不同樣品的質(zhì)譜圖，確定哪種蛋白質(zhì)相互作用。缺點(diǎn)是需要充足的純化和樣品預(yù)處理。
三、總結(jié)
cDNA文庫(kù)構(gòu)建是高效快捷地獲取目標(biāo)基因cDNA序列和表達(dá)的方法�；プ鞯鞍缀Y選方法主要有酵母雙雜交法、噬菌體展示技術(shù)和質(zhì)譜分析法。這些技術(shù)在研究與治療人類(lèi)疾病等方面具有廣泛應(yīng)用前景。
